Die Diagnose Down-Syndrom kann meist durch eine ärztliche Untersuchung der betreffenden Person gestellt werden. Im Neugeborenenalter ist die Feststellung mitunter schwierig.

Durch eine Chromosomenanalyse aus Lymphozyten des Bluts kann nicht nur die Diagnose gesichert, sondern auch die Art der Trisomie 21 ermittelt werden. Während der Schwangerschaft besteht die Möglichkeit, die Trisomie 21 beim Embryo durch die Chromosomenanalyse mithilfe so genannter invasiver Diagnostik wie der Chorionzottenbiopsie, Fetalblutentnahme oder Amniozentese zu diagnostizieren.

Eine vorgeburtliche Chromosomenanalyse steht in Deutschland allen Frauen ab 35 Jahren als Routineuntersuchung offen. Die Genauigkeit eines derartigen vorgeburtlichen Tests liegt höher als 99,9 Prozent, der Nachweis kann damit als nahezu sicher angesehen werden.